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Escala de eficiência para espalhamento de partículas luminescentes ligada a propriedades espectroscópicas fundamentais e mensuráveis

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Escala de eficiência para espalhamento de partículas luminescentes ligada a propriedades espectroscópicas fundamentais e mensuráveis

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 6254 (2023) Citar este artigo 514 Acessos Detalhes de métricas Comparando o desempenho de luminóforos moleculares e em nanoescala e micro e luminescentes

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 6254 (2023) Citar este artigo

514 Acessos

Detalhes das métricas

Comparar o desempenho de luminóforos moleculares e em nanoescala e micro e nanopartículas luminescentes e estimar amplitudes de sinal alcançáveis ​​e limites de detecção requer uma escala de intensidade padronizável. Isso iniciou o desenvolvimento das escalas relativas MESF (número de moléculas de fluorocromos solúveis equivalentes) e ERF (fluoroforos de referência equivalentes) para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Ambas as escalas de intensidade baseiam-se em valores de intensidade de fluorescência atribuídos a esferas de calibração fluorescentes por uma comparação de intensidade com soluções de fluoróforo espectralmente correspondentes de concentração conhecida usando um espectrofluorômetro. Alternativamente, o brilho do luminóforo ou do cordão (B) pode ser determinado de forma que seja igual ao produto da seção transversal de absorção (σa) no comprimento de onda de excitação (σa(λex)) e o rendimento quântico de fotoluminescência (Φpl). Assim, pode ser realizada uma escala absoluta baseada em propriedades espectroscópicas fundamentais e mensuráveis, que é independente do tamanho da partícula, material e coloração do luminóforo ou densidade de marcação e considera a sensibilidade das propriedades ópticas dos luminóforos ao seu ambiente. Com o objetivo de estabelecer tal escala de brilho para dispersões de dispersão de luz de partículas luminescentes com tamanhos superiores a alguns dez nanômetros, demonstramos como o brilho de partículas de poliestireno (PSP) quase monodispersas de 25 nm, 100 nm e 1 µm, carregadas com dois corantes diferentes em concentrações variadas podem ser obtidos com uma única configuração de esfera integradora personalizada que permite a determinação absoluta de Φpl e medições de transmitância e refletância difusa. O Φpl resultante, σa(λex), partes imaginárias do índice de refração e valores B calculados dessas amostras são dados na dependência do número de moléculas de corante incorporadas por partícula. Finalmente, é definida uma eficiência de luminescência sem unidade (LE), permitindo a comparação direta das eficiências de luminescência de partículas com tamanhos diferentes.

Nas últimas décadas, nanopartículas (NPs) e micropartículas (MPs), coradas ou codificadas com diferentes tipos de luminóforos moleculares e nanocristalinos, têm sido cada vez mais utilizadas nas ciências da vida e dos materiais. As aplicações típicas variam de repórteres ópticos para ensaios de fluorescência e sistemas de bioimagem e distribuição de medicamentos, passando por etiquetas de autenticação imprimíveis e plataformas baseadas em esferas para citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e separação imunológica, até sensores de partículas e ferramentas de calibração para diferentes métodos de fluorescência, particularmente para citometria de fluxo. ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. A maioria dos métodos de fluorescência que exploram NPs e MPs emissivos, como espectroscopia de fluorescência, microfluorometria, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, medem apenas intensidades de fluorescência relativas específicas do instrumento . A comparação confiável de medições de fluorescência entre diferentes instrumentos e diferentes laboratórios requer uma calibração do instrumento para determinar e considerar as contribuições de sinal específicas do instrumento, como a responsividade espectral dependente do comprimento de onda do canal de detecção do instrumento, que afeta os espectros de emissão medidos . Para a quantificação de, por exemplo, analitos ou a comparação de diferentes amostras fluorescentes com diferentes técnicas de fluorescência, normalmente é realizada uma calibração relativa da escala de intensidade de fluorescência utilizando soluções de fluoróforo de concentrações conhecidas, propriedades de luminescência e, particularmente, espectros de emissão que correspondem estreitamente aos do amostra utilizando as mesmas configurações do instrumento aplicadas para a medição da amostra17. Isso é simples para amostras luminescentes transparentes, por exemplo, aplicações de detecção ou quantificação de luminóforos com técnicas de separação cromatográfica, como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detecção de fluorescência, mas é um desafio para sistemas de dispersão de luz. No entanto, a maioria das dispersões de NPs e MPs fluorescentes amplamente utilizadas dispersam a luz de excitação, dependendo do seu tamanho e do índice de refração e do ambiente das partículas. Isto pode afectar a sua caracterização fluorométrica e particularmente as medições das suas características de absorção com espectrofotómetros comuns e espectrofluorómetros concebidos para a medição de amostras transparentes.

 0). The normalized absorbance and emission spectra of aqueous dispersions of these differently sized PSP loaded with Nile Red and Itrybe are displayed in the SI in Fig. S5. Due to the dye staining of the particles via a previously optimized swelling procedure assessed, e.g., microscopy, the dye molecules can be assumed to be homogeneously distributed within the particles, and the spherical shape of the particles is preserved in the process.12,41,42,44 This allows for a data analysis based on Mie Theory, like with the unstained particles discussed above. The absorbance and emission spectra of Itrybe-loaded PSP are broadened compared to the parent molecule in ethanol, yet the respective absorption and emission maxima match. In the case of solvatochromic Nile Red, the absorbance and emission bands of Nile Red-stained PSP are red shifted with decreasing PSP size, pointing to an increasingly polar microenvironment faced by the dye molecules with reduced PSP size and hence increased surface-to-volume ratio. The corresponding \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of aqueous dispersions of Nile Red- and Itrybe-loaded PSPs in dependence on PSP size and loading concentration, i.e., the average dye-dye distance are shown in Fig. 4. This figure reveals opposite trends for the particle size- and dye loading-dependent \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of both dyes. As shown in the left panel of Fig. 4, the \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) values of Nile Red-stained PSP decreased with decreasing PSP size and increased surface-to-volume ratio. In contrast, for PSP containing Itrybe molecules, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) decreased with increasing particle size (right panel of Fig. 4. For both dyes, an increase in dye loading concentration resulted in a diminution of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (see also SI, Fig. S7). We attribute these trends to (1) the influence of the polar particle environment particularly in the case of the charge transfer dye Nile Red, the fluorescence of which is known to be quenched by hydrogen bonding interactions and polarity as follows also from the solvatochromic emission behavior of Nile Red (see SI, Fig. S5), (2) dye-dye interactions, and (3) energy transfer processes between dye molecules in the PSP. The latter two factors are supported by the dependence of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) on dye loading concentration (see Fig. 4 and SI, Fig. S7)66,67,68,69,70. µa(λ) and µs(λ) of the dispersed 1 µm and 100 nm dye loaded PSPs determined by radiation transport and Mie Theory are shown in Fig. 5. For the 25 nm sized particles the scattering contributions were too small to be used for quantification and represent the physical size limit for our study and method development. For the fit of µa(λ) and µs(λ), we considered the contribution of the dye molecules to the dielectric function of the particle matrix by increasing the imaginary part of the refractive index. In a first step, n2 was used as a free variable and it was assumed that the particle matrix is homogeneously loaded with dye molecules. The resulting σa(λ) values are shown in Fig. 6. The resulting Np and rp values were also used for the determination of σa(λ) from µa(λ) calculated from the radiation transport theory. For the particle sizes and dye concentrations used here, the direct determination of σa(λ) from Mie calculations and calculations using radiation transport theory are in good agreement as displayed in Fig. 5./p>

3.0.co;2-i" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819960315%2926%3A1%3C22%3A%3Aaid-cyto4%3E3.0.co%3B2-i" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:13.0.co;2-i"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

3.0.CO;2-X" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C213%3A%3AAID-CYTO16%3E3.0.CO%3B2-X" aria-label="Article reference 22" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:23.0.CO;2-X"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

3.0.co;2-q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C188%3A%3Aaid-cyto13%3E3.0.co%3B2-q" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:23.0.co;2-q"Article CAS PubMed Google Scholar /p>